دانلود پایان نامه

نور محفوظ گردد.
آماده ساختن سايز مارکر (Fermentas)
سايز مارکر استوک 50 ميکروليتر
آب مقطر استريل 200ميکروليتر
بافر لودينگ 50 ميکروليتر
طول قطعات سايز مارکر بر حسب جفت باز (100، 200، 300، 500، 600، 700، 800، 900، 1000، 2000، 3000، 4000، 5000bp )
تهيه ژل آگارز 1% و الکتروفورز محصولات PCR
1- 5/0 گرم پودر آگارز را در يک ارلن 50 ميلي ليتري ريخته و تا حجم 50 ميلي ليتر بافر TBE (X1) اضافه گرديد، سپس به وسيله گرمکن الکتريکي حرارت داده تا ذرات آگارز حل شود محلول به جوش آمده و محلول شفاف بدست آيد. حال ارلن را از روي حرارت برداشته تا کمي خنک شود و دوبار اين کار را تکرار ميکنيم، نتيجه اين عمل ايجاد ژل شفاف و يکدست خواهد بود.
2- در مرحله بعد، پس از برداشتن ارلن از روي شعله اجازه ميدهيم دماي ژل پايين بيايد. در زير هود و در شرايط مراقبتي ويژه، زماني که دماي ارلن به 50 تا 60 درجه سانتي گراد رسيد 2 ميکروليتر اتيديوم برومايد به آن اضافه شد و کاملاً مخلوط گرديد.
3- سيني ژل را داخل قالب آن قرار داده و شانه روي سيني با فاصله 6-4 ميلي متر قرار داده مي شود.
4- آگارز مذاب را داخل سيني مخصوص ژل ريخته تا ژل سفت شود.
5- بعد از بستن ژل شانه را به آرامي از آن خارج کرده به طوري که آسيبي به چاهک هاي ايجاد شده وارد نشود.
6- سيني حاوي ژل داخل تانک الکتروفورز حاوي TBE (X1) قرار داده شد به طوري که سطح ژل توسط TBE (X1) به اندازه يک سانتي متر پوشيده شود.
7- در يکي از چاهک ها 4 ميکروليتر سايز مارکر ريخته شد.
8- در چاهک ديگري نمونه کنترل منفي و در بقيه چاهک ها محصولات PCR شده بيماران ريخته شد. براي اين منظور 10 ميکروليتر از محصولات PCR را با 2 ميکروليتر بافر بارگذاري مخلوط کرده و در هر يک از چاهک هاي ژل ريخته شد.
9- درپوش تانک گذاشته شده و سيم هاي منبع تغذيه به الکترودهاي تانک وصل گرديد.
10- دستگاه مولد جريان ولتاژ آن را روي 60 ولت و تايمر را روي يک ساعت تنظيم گرديد.
11- پس از رسيدن رنگ آبي به 4/3 انتهايي ژل، منبع تغذيه خاموش گرديد.
12- ژل به دستگاه داکيومنتيشن منتقل و عکس گرفته شد.
13- تکثير قطعه مورد نظر از طريق مقايسه وجود باند در اندازه مورد نظر (bp521) با سايز مارکر مشخص شد.
در صورتيکه به هر علت باند کاذب يا عدم وجود باند مشاهده شد، کل فرآيند تکرار گرديد.
شرايط تعيين توالي در انستيتوپاستور
تعيين توالي بر روي محصول PCR، پلاسميد وکاسميد قابل انجام است. اين کار توسط دستگاه Genetic Analyzer3130 ساخت کمپاني ABI آمريکا با دقت بسيار بالا انجام ميگيرد. براي تعيين توالي DNA لازم است نمونه هاي DNA به همراه پرايمرهاي مربوطه ارسال شود.
قبل از ارسال نمونه، نکات زير رعايت گرديد:
1. نمونه روي ژل آگاروز ران شده و عکس ژل ارسال گرديد.
2. عکس ژل واضح و به گونه اي بود که وجود باند اختصاصي، غير اختصاصي و دايمر پرايمر نيز مشخص شده بود.
3. نام و مقدار (ميکروليتر)DNA لود شده بر روي ژل بايستي بر روي عکس نيز درج گرديد.
4. نمونه ها (DNA و پرايمرها) در تيوب هاي 5/0 ميلي ليتري ريخته شده و حاوي برچسب خوانا بود.
5. نمونهها در ظرف و شرايط مناسب (دماي کمتراز 15 درجه) ارسال گرديد.
6. نبايد درب تيوپ هاي حاوي نمونه با پارافيلم بسته ميشد.
7. نمونه از نظر وجود باند غير اختصاصي و دايمر پرايمر خالص سازي گشت؛ که در مرحله نهايي بجاي ايلوشن بافر از آب مقطر (ترجيحاً آب مقطر تزريقي) گرم (40 درجه و بمقدار 30 مايکروليتر) استفاده گرديد.
8. مقدار مورد نياز از هر نمونه به غلظت آن بستگي داشت ولي بطور متوسط از هر نمونه حداقل 10 مايکروليتر ارسال گرديد.
9. غلظت پرايمرهاي ارسالي 10 پيکومول بود و غلظت و نام پرايمر بر روي ليبل ذکر گرديد. مقدار مورد نياز از هر پرايمر 10 پيکومولي، حداقل 10 مايکرو ليتر بود.
10. نمونه هاي ارسالي پس از انجام کار حداکثر بمدت يک ماه در آن مرکز نگهداري و سپس دور ريخته مي شود.
توالي يابي ژن ها و ژنوم ها
توالي يابي ژن ها حدود 40 سال است که مطرح شده است و از اواسط دهه 1970 توالي يابي سريع و کارآمد امکان پذير شده است در آغاز، اين روش ها براي ژنهاي منفرد کاربرد داشت اما از اوايل دهه 1990 تعداد رو به افزايشي از توالي هاي کل ژنومي به دست آمده است.
شناخت روش هاي توالي يابي
روش هاي متعددي براي توالي يابي DNA وجود دارد مرسوم ترين روش که در اواسط دهه 1970 و براي اولين بار بوسيله فرد سنگر214 و همکارانش اختراع شد، روش خاتمه زنجيره215 مي باشد. اين روش به دلايل متعدد به عنوان روش برگزيده مي باشد که از اهم اين دلايل سهولت نسبي اين روش براي استفاده از آن در توالي يابي هاي خودکار است.
توالي DNA به روش خاتمه زنجيره
توالي يابي DNA به روش خاتمه زنجيره بر اين اصل استوار است که مولکول هاي DNA تک رشته اي که تفاوت طول آن ها فقط در يک نوکلئوتيد است قابل جداسازي با پلي اکريلاميد ژل الکتروفوز هستند اين بدان معناست که امکان تفکيک مجموعه اي از مولکول ها که در برگيرنده تمام اندازه هاي پلي نوکلئوتيدي از 10 تا 1500 نوکلئوتيد است به صورت مجموعه اي از نوارها روي ژل صفحه اي يا موئينه وجود دارد.
نگاهي اجمالي به توالي يابي به روش خاتمه زنجيره
مواد آغازگر جهت توالي يابي DNA به روش فوق شامل تهيه مولکول هاي DNA تک رشته اي يکسان است. قدم اول، متصل کردن يک اليگونوکلئوتيد کوتاه (پرايمر) به يک محل مشابه در هر مولکول تک رشته اي مي باشد که مکمل رشته الگو است عمل مي کند.
واکنش سنتز رشته جديد با آنزيم DNA پليمراز و در حضور چهار دئوکسي ريبون
وکلئوتيد تري فسفات (d-GTP, dTTP, dATP, dCTP- dNTP) به عنوان سوبسترا مي تواند تا پليمريزه شدن هزاران نوکلئوتيد ادامه يابد؛ اما در روش خاتمه زنجيره، اين مسأله اتفاق نمي افتد؛ زيرا علاوه بر چهار دئوکسي نوکلئوتيد تعداد محدودي از چهار نوع دي دئوکسي نوکلئوتيد (ddGTP, ddTTP, ddATP,ddCTP- ddNTP) نيز به واکنش اضافه مي شود که علاوه بر نبود OH در جايگاه 2َ، در جايگاه 3َ نيز فاقد OH است. هر کدام از اين چهار دي دئوکسي نوکلئوتيد داراي يک نشانگر فلورسنت متفاوت هستند.
آنزيم پليمراز قادر به افتراق بين دئوکسي و دي دئوکسي نوکلئوتيد نيست اما در صورتي که از دي دئوکسي نوکلئوتيد استفاده شود، واکنش طويل سازي متوقف مي شود زيرا گروه 3َ- هيدروکسيل که براي اضافه شدن نوکلئوتيد بعدي مورد نياز است وجود ندارد به علت وجود دئوکسي نوکلئوتيد در مقادير بيشتر از دي دئوکسي نوکلئوتيد، واکنش غالباً در ابتدا و در نزديک به پرايمر توقف نمي کند در حقيقت، قبل از اضافه شدن يک دي دئوکسي نوکلئوتيد ممکن است صدها نوکلئوتيد پليمريزه شده باشد نتيجه اتفاقات فوق، مجموعه اي از مولکول هاي جديد با اندازه هاي مختلف است که هر مولکول به يک دي دئوکسي نوکلئوتيد با نشانگري که معرف نوکلئوتيد خاص (A, C, G يا T) مي باشد ختم شده است. محل اين نوکلئوتيد منطبق با محل آن در رشته الگو مي باشد.
براي مشخص کردن توالي DNA، تمام کاري که بايستي انجام گيرد مشخص کردن دي دئوکسي نوکلئوتيد انتهاي هر مولکول خاتمه يافته است. در اينجا از ژل پلي آکريلآميد استفاده مي شود زيرا توان تمايزي بسيار بيشتري نسبت به آگارز دارد. بعد از جداسازي، مولکول ها از مقابل آشکارساز فلورسانتي عبور مي کنند که مي تواند نشانه هاي متصل به دي دئوکسي نوکلئوتيدها را مشخص کند بنابراين آشکار ساز تعيين مي کند که هر مولکول با کدام يک از نوکلئوتيدهاي A, C, G يا T خاتمه يافته است. توالي حاصل مي تواند جهت بررسي چاپ شده و در اختيار متصدي قرار گيرد يا اينکه جهت تجزيه و تحليل در آينده درون يک دستگاه حافظه اطلاعات ذخيره گردد.
همه آنزيم هاي DNA پليمراز را نمي توان براي توالي سازي استفاده کرد
هر آنزيم DNA پليمراز قادر به گسترش پرايمر متصل به مولکول DNA تک رشته است اما همه آنزيم هاي پليمراز را نمي توان براي توالي يابي DNA به کار برد. علت اين است که بسياري از DNA پليمرازها داراي مخلوطي از چند فعاليت آنزيمي هستند که امکان تجزيه DNA را در کنار سنتز آن فراهم مي سازد تجزيه در هر دو جهت 5َ به 3َ و 3َ به 5َ مي تواند صورت پذيرد و هر دو فعاليت براي توانايي صحيح به روش خاتمه زنجيره مشکل زا هستند. فعاليت اگزونوکلئازي 5َ به 3َ سبب مي شود که آنزيم پليمراز نوکلئوتيدها را از انتهاي 5َ رشته هاي تازه سنتز شده حذف کند که طول اين رشته ها را تغيير مي دهد و امکان توالي را از روي الگو نوارها ايجاد نشده روي ژل پلي اکريلاميد غير ممکن مي سازد. فعاليت 3َ به 5َ مي تواند اگر مشابهي داشته باشد اما عمدتاً ddNTP را که در انتهاي 3َ رشته اضافه شده است را حذف مي کند و مانع خاتمه زنجيره مي شود.
در روش اصلي توال يابي با روش خاتمه زنجيره، از آنزيم پلي مراز کلنو به عنوان آنزيم توالي يابي استفاده شده است. اين آنزيم نوع تغيير يافته اي از آنزيم DNA پليمراز I باکتري E.Coli است. اين تغيير شامل حذف فعاليت اگزونوکلئازي 5َ به 3َ آنزيم استاندارد است، با وجود اين، آنزيم پليمراز کلنو داراي پيمايش پاييني است يعني قبل از آن که به واسطه عوامل طبيعي از رشته الگو جدا شود، تنها بخش نسبتاً کوتاهي از رشته الگو جدا شود، تنها بخش نسبتاً کوتاهي از رشته DNA را سنتز مي نمايد. اين ويژگي طول توالي بدست آمده از يک واکنش را به حدود 250 جفت باز محدود مي کند. براي اجتناب از اين مشکلات، اغلب دستگاه هاي توالي يابي امروزي از آنزيم اختصاصي تري مثل آنزيم سکوناز که نوع تغيير يافته آنزيم DNA پليمراز کد شده توسط باکتريوفاژ T7 است، استفاده مي کنند. اين آنزيم داراي پيمايش بالايي است و فعاليت اگزوتئکلئازي ندارد و لذا براي توالي يابي به روش خاتمه زنجيره مناسب بوده و امکان تعيين 750 باز در هر آزمايش را مي دهد.
پرايمر مي تواند ناحيه اي ناحيه اي از DNA الگو را که قرار است مورد توالي يابي قرار گيرد مشخص کند
در اولين مرحله از توالي يابي به روش خاتمه زنجيره، يک پرايمر اليگونوکلئوتيدي به رشته DNA الگو متصل مي گردد. عملکرد اصلي پرايمر، فراهم کردن يک منطقه کوتاه دو رشته اي مي باشد که براي شروع سنتز DNA توسط DNA پليمراز ضروري است. دومين نقش حياتي پرايمر، تعيين ناحيه اي از مولکول الگو است که قرار است تحت عمليات توالي يابي قرار گيرد.
نحوه مقايسه توالي محصول PCR در بانک ژني
جهت يافتن توالي مورد نظر از بانک ژني از نرمافزار Choromaspro version 1.41 استفاده شد به اينصورت که توالي را در نرم افزار Blast کپي کرده و با توالي موجود در بانک ژني مقايسه کرديم. (به ترتيب از ‏شکل (3-3) الي ‏شکل (3-6) ). توالي مورد نظر در ژن، توالي GCCTGAT//GGCCACACCCAA//CGGAA و نوکلئوتيد هاي مورد بحث، در نقاط مشخص شده T//G و A//C مورد بررسي قرار گرفته و ژنوتايپ نمونهها مشخص گرديد.

توالي مورد نظر با استفاده از نرمافزار Choromaspro version 1.41 بررسي گرديد.

از امکانات ديگر نرمافزار Choromaspro version 1.41 بررسي توالي با استفاده از کروماتوگرام است

پس از حصول اطمينان از وجود توالي مورد نظر، با استفاده از نرم افزار موجود در سايت PUBMED، توالي را BLAST کرديم.

توالي مورد نظر را با توالي موجود در بانک ژني مقايسه کرديم.

نتايج و بحث
نتايج حاصل از جمعآوري نمونهها
از تعدا 15 کودک با تشخيص قطعي سرطان خون لنفوئيدي حاد (ALL) توسط روش فلوسايتومتري، 15 نمونه خون همراه ماده ضد انعقاد گرفته شد.
اطلاعات دموگرافيک بدست آمده از 15 بيمار تا انتهاي مطالعه به شرح زير ميباشد.
از 15 بيمار 11 بيمار پسر و 4 بيمار دختر بودند. (نمودار ‏شکل (4-1) )
ميانگين سني اين افراد 6/4 بود که با توجه به انحراف معيار 7/2 ميتوان گفت که توزيع نرمال بودهاست. توزيع سني کودکان در نمودار ‏شکل (4-2) گزارش گرديدهاست.
همه 15 بيمار با تشخيص ALL بودند.
از مجموع 15 بيمار مورد مطالعه 6 بيمار با درمان نگهدارنده216 T- Cell217 و 9 بيمار با درمان نگهدارنده B- Cell218 pre مورد درمان قرار گفتند.

نمودار توزيع پراکندگي جنسي افراد بيمار شرکت کننده در مطالعه

نمودار توزيع فراواني سني افراد بيمار شرکت کننده در مطالعه
نتايج حاصل از کنترل پروسه استخراج
نتايج استخراج DNA به روش فنلکلروفرم نشان داد که در برخي از نمونههاي استخراج شده توسط اين روش عمل آمپليفاي شدن219 DNA احتمالاً به علت وجود ممانعت کنندههاي220 موجود، به سختي صورت گرفت و محصول PCR حاصل از همان نمونه توسط کيت تجاري استخراج شده بود، دارايي باند بهتري بود. اين يعني در نمونههاي استخراج شده DNA توسط کيت، عمل PCR بهتر صورت گرفته که اين امر کمتر بودن ممانعت کنندهها را در DNA بهدست آمده از روش کيت را نشان ميدهد.
نتايج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR بهدست آمده در اين مطالعه توسط سايبرگرين هيچ تفاوتي با تکرار همان الکتروفورز توسط اتيديوم برومايد نشان نميدهد به همين دليل و با در نظر داشتن سرطانزايي اتيديوم بومايد، توصيه ميگردد از اين پس از سايبرگرين به جاي اتيديوم برومايد استفاده گردد.
نتايج حاصل از کنترل فرآيند PCR
بر روي تمامي نمونههاي بافيکوت بدست آمده از بيماران و افراد کنترل پس از انجام پروسه استخراج DNA، فرآيند PCR انجام پذيرفت. پرايمر بهکار رفته بر روي ژن Gc نشسته و قطعات pb521 را تکثير نمود و محصول حاوي قطعات مذکور بر روي ژل آگارز جهت بررسي حضور باند با وزن فوق، الکتروفورز شد. ‏شکل (4-3) نشاندهنده باندهاي ناشي از وجود DNA مورد نظر در نمونهها ميباشد.

باند pb521 محصول PCR توسط ژن طراحي شده جهت تکثير ژن Gc
Lad شاخص مولکولي pb100، Neg: کنترل منفي، ستونهاي 1 الي 7 باند pb 521 را نشان ميدهند.
در صورتي که به هر صورت باند کاذب يا عدم وجود باند مشاهده شد، کل فرآيند تکرار گرديد.
پس از حصول اطمينان از وجود باند مورد نظر DNA ها جهت توالي يابي ارسال گرديد.
نتايج حاصل از توالي يابي
روند بررسي توالي نمونه هاي ارسال شده در چند مورد در تصاوير زير آورده شده است. ‏شکل (4-4) الي ‏شکل (4-6) مربوط به ژن Gc1F و ‏شکل (4-7) مربوط به ژن Gc1S ميباشد. مراحل بررسي اين چهار توالي از بين 28 توالي به عنوان نمونه در ذيل بيان گرديد. جمع بندي بررسي توالي در ادامه مطالب ذکر خواهد شد. توالي مورد نظر در ژن، توالي GCCTGAT//GGCCACACCCAA//CGGAA و نوکلئوتيد هاي مورد بحث، در نقاط مشخص شده T//G و A//C مورد بررسي قرار گرفته و ژنوتايپ


پاسخی بگذارید